คำตอบสั้น ๆ: ลำดับที่ใช้งานได้คือ เตรียมพื้นที่สะอาด คำนวณและติดฉลาก ดูด master mix กับตัวอย่างด้วยทิปใหม่ ผสมตามระดับที่วิธียอมรับ ทำ short spin ให้ของเหลวลงก้น แล้วใช้โปรแกรมเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมที่ตรวจสอบแล้ว

ความน่าเชื่อถือของ PCR ขึ้นกับงานก่อนการวิเคราะห์ทั้งหมด ไม่ใช่เฉพาะ thermal cycler ความคลาดเคลื่อนปริมาตร ละออง รีเอเจนต์ผสมไม่ทั่ว และหยดบนผนังหลอดเพิ่มความแปรปรวนได้

เวิร์กโฟลว์ที่ประสานกันใช้ ปิเปตความแม่นยำ, เครื่องวอร์เท็กซ์ และ เครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดเล็ก ก่อนการเพิ่มปริมาณใน งาน PCR ที่เหมาะสม.

เนื้อหาในบทความนี้:

• เตรียมเขตสะอาด
• ลำดับที่ทำซ้ำได้
• เมื่อใดควรวอร์เท็กซ์
• การควบคุมการปนเปื้อน

เตรียมพื้นที่ทำงาน

• แยกวัสดุก่อนและหลัง amplification
• ทำความสะอาดพื้นผิวตาม SOP
• ละลายและจัดการรีเอเจนต์ตามชุดทดสอบ
• ติดฉลากก่อนเติมตัวอย่าง
• ใช้ปิเปตเฉพาะเขตและสอบเทียบเมื่อกำหนด

ลำดับการเตรียม

1. คำนวณปริมาตรปฏิกิริยาและ master mix พร้อมเผื่อการสูญเสีย
2. เตรียม master mix ในเขตสะอาด
3. แบ่งลงหลอดหรือหลุม
4. เติม template ด้วยทิปใหม่ทุกตัวอย่าง
5. ปิดหลอดหรือซีลเพลต
6. ผสมตามคำแนะนำ
7. ทำ short spin
8. โหลดโปรแกรมที่ถูกต้องและตรวจตำแหน่ง

วอร์เท็กซ์ ปิเปตผสม หรือกลับหลอด?

ทำตามคำแนะนำรีเอเจนต์หรือชุดทดสอบ อย่าถือว่าส่วนผสมเอนไซม์ทุกชนิดวอร์เท็กซ์ได้.

ลดการปนเปื้อนและความแปรปรวน

• ใช้ทิปกรองเมื่อกำหนด
• เปลี่ยนทิประหว่างทุกตัวอย่างและการถ่ายที่เสี่ยง
• ปิดหลอดนอกช่วงเติม
• ใช้ positive, negative และ no-template control ตามวิธี
• บันทึกล็อต ปิเปต รุ่นโปรแกรม และความเบี่ยงเบน

อุณหภูมิและเวลาการทำรอบขึ้นกับ assay ไม่ควรแทนด้วยค่าทั่วไปจากบทความ.

คำถามที่พบบ่อย

ควรวอร์เท็กซ์ PCR master mix หรือไม่?

เฉพาะเมื่อคำแนะนำรีเอเจนต์อนุญาต บางสูตรทนการวอร์เท็กซ์สั้น ๆ ส่วนบางสูตรต้องผสมเบา.

ทำไมต้อง short spin ก่อนทำ PCR?

เพื่อให้หยดบนผนังและฝาลงสู่ก้นหลอด ทำให้ปริมาตรทั้งหมดอยู่ในโซนอุณหภูมิ.

ใช้ปิเปตเดียวกันก่อนและหลัง amplification ได้หรือไม่?

หลายห้องแยกอุปกรณ์ตามเขตเพื่อลด amplicon contamination ให้ทำตามแผนควบคุมของสถานที่.

ข้อสรุปสำคัญ

ทำให้ลำดับงานเป็นมาตรฐาน ไม่ใช่เฉพาะค่าของเครื่อง: ทำความสะอาด คำนวณ ปิเปต ผสม spin ตรวจ และทำรอบ.