Trả lời nhanh: Trình tự thực tế là: chuẩn bị khu vực sạch, tính và ghi nhãn phản ứng, pipet master mix và mẫu bằng tip mới, trộn theo mức phương pháp cho phép, spin-down ngắn để gom dung dịch xuống đáy, rồi chạy chương trình PCR đã xác nhận.
Độ tin cậy PCR phụ thuộc toàn bộ giai đoạn tiền phân tích, không chỉ máy chu kỳ nhiệt. Sai số thể tích nhỏ, aerosol, thuốc thử chưa đồng nhất và giọt bám thành ống đều làm tăng biến thiên.
Một hệ thống phối hợp có thể dùng pipet chính xác, máy vortex và máy ly tâm mini trước bước khuếch đại trong quy trình PCR phù hợp.
Nội dung chính:
- Chuẩn bị khu vực sạch
- Trình tự có thể lặp lại
- Khi nào vortex
- Kiểm soát nhiễm
Chuẩn bị khu vực làm việc
- Tách vật liệu trước và sau khuếch đại
- Làm sạch bề mặt theo SOP
- Rã đông và xử lý thuốc thử theo hướng dẫn xét nghiệm
- Ghi nhãn trước khi thêm mẫu
- Dùng pipet chuyên dụng đã hiệu chuẩn khi cần
Trình tự chuẩn bị
- Tính thể tích phản ứng và master mix, cộng hao hụt pipet
- Chuẩn bị master mix ở khu sạch
- Chia master mix vào ống hoặc giếng
- Thêm mẫu bằng tip mới cho từng mẫu
- Đóng ống hoặc dán plate
- Trộn theo hướng dẫn
- Spin-down ngắn
- Nạp chương trình chu kỳ đúng và kiểm tra vị trí mẫu
Vortex, trộn bằng pipet hay đả
o nhẹ?
| Cách trộn | Khi dùng | Lưu ý |
|---|---|---|
| Vortex | Thuốc thử cho phép trộn nhanh | Tránh bọt và aerosol |
| Pipet lên xuống | Thể tích nhỏ cần kiểm soát | Tránh bọt và nhiễm chéo |
| Đảo nhẹ | Mẫu dễ tạo bọt hoặc nhạy | Có thể chưa đủ cho phản ứng rất nhỏ |
Luôn theo hướng dẫn thuốc thử hoặc xét nghiệm; không mặc định mọi hỗn hợp enzyme đều được vortex.
Giảm nhiễm và biến thiên
- Dùng tip lọc khi yêu cầu
- Thay tip giữa mỗi mẫu và lần chuyển có nguy cơ nhiễm chéo
- Giữ ống đóng ngoài thời gian thêm mẫu
- Dùng đối chứng dương, âm và không mẫu theo phương pháp
- Ghi lô, pipet, phiên bản chương trình và sai lệch
Nhiệt độ và thời gian chu kỳ phụ thuộc xét nghiệm, không nên thay bằng một cài đặt chung từ bài blog.
Câu hỏi thường gặp
Có nên vortex master mix PCR không?
Chỉ khi hướng dẫn thuốc thử cho phép. Một số hỗn hợp chịu được vortex ngắn; loại khác cần trộn nhẹ.
Tại sao spin-down ống trước PCR?
Spin ngắn đưa giọt trên thành và nắp xuống đáy để toàn bộ thể tích nằm trong vùng nhiệt.
Có thể dùng cùng pipet trước và sau khuếch đại không?
Nhiều phòng tách thiết bị theo khu vực để giảm nhiễm amplicon. Hãy theo kế hoạch kiểm soát nhiễm của cơ sở.
Điểm cần nhớ
Chuẩn hóa thứ tự công việc, không chỉ thông số máy: làm sạch, tính, pipet, trộn, spin, kiểm tra và chạy chu kỳ.
