ข้อสำคัญ: ปฏิบัติตามคู่มือ ขีดจำกัดของโรเตอร์ พิกัดของหลอด SOP ของห้องปฏิบัติการ และข้อกำหนดด้านความปลอดภัยในพื้นที่เสมอ
วิธี Forward Pipetting
ใส่ทิปที่พอดีและ pre-wet เมื่อจำเป็น กดลูกสูบถึงจุดหยุดแรก จุ่มปลายทิปตื้น ๆ แล้วปล่อยลูกสูบช้า ๆ รอสั้น ๆ จากนั้นจ่ายชิดผนังภาชนะโดยกดผ่านจุดแรกถึงจุดที่สอง ถอนทิปก่อนปล่อยลูกสูบ
วิธี Reverse Pipetting
กดลูกสูบถึงจุดหยุดที่สองก่อนจุ่มทิป ปล่อยช้า ๆ เพื่อดูดของเหลว จ่ายลงภาชนะรับถึงจุดหยุดแรกเท่านั้น ค้างลูกสูบไว้ขณะถอนทิป แล้วทิ้งของเหลวที่เหลือและทิปอย่างเหมาะสม
ตารางเปรียบเทียบ
| หัวข้อ | Forward | Reverse |
|---|---|---|
| เหมาะกับ | สารละลายใกล้น้ำ | ของเหลวหนืดหรือเกิดฟอง |
| เริ่มดูดที่ | จุดหยุดแรก | จุดหยุดที่สอง |
| จ่ายถึง | จุดหยุดที่สอง | จุดหยุดแรก |
| ของเหลวคงเหลือ | เป่าออกตามปกติ | ตั้งใจให้เหลือในทิป |
| ข้อดี | ง่ายและใช้ตัวอย่างคุ้มค่า | ลดฟองและการเกาะทิป |
เมื่อใดควรพิจารณาวิธี Reverse
- สารละลายที่มีกลีเซอรอล
- สารละลายโปรตีนที่เกิดฟองง่าย
- บัฟเฟอร์ที่มีสารลดแรงตึงผิว
- รีเอเจนต์ที่มีความหนืดปานกลาง
- master mix บางชนิดในปริมาตรต่ำ
ของเหลวระเหยง่ายและของเหลวยาก
ของเหลวระเหยง่ายทำให้ความดันไอเปลี่ยนเบาะอากาศและอาจเกิดหยด การ pre-wet ทำงานด้วยจังหวะคงที่ และลดการถ่ายเทความร้อนจากมือช่วยได้ สำหรับของเหลวที่ระเหยง่ายมาก หนืดมาก หรือมีความหนาแน่นต่างจากน้ำมาก ไพเพตแบบ positive displacement อาจเหมาะกว่าการเปลี่ยนเทคนิคเพียงอย่างเดียว
ข้อผิดพลาดที่พบบ่อย
- ปล่อยลูกสูบเร็วเกินไป
- ถือไพเพตเอียงขณะดูด
- จุ่มทิปลึกเกินไป
- เปลี่ยนความเร็วและเวลาหยุดระหว่างซ้ำ
- ใช้ทิปหลวมหรือไม่เข้ากัน
- เทของเหลวคงเหลือจาก Reverse กลับขวดต้นทาง
เลือกช่วงปริมาตรให้ถูกต้อง
เทคนิคไม่สามารถชดเชยการเลือกช่วงปริมาตรผิดได้ เลือก ไมโครไพเพต ที่มีช่วงครอบคลุมค่าที่ต้องการ ใช้ทิปที่เข้ากัน และล็อกปริมาตรเมื่อต้องทำงานซ้ำจำนวนมาก
คำถามที่พบบ่อย
Reverse แม่นกว่าหรือไม่
ไม่ใช่กับทุกของเหลว วิธีนี้อาจทำซ้ำได้ดีกว่าสำหรับของเหลวหนืดหรือมีฟอง ส่วน Forward เหมาะกับสารละลายทั่วไป
นำของเหลวที่เหลือกลับขวดได้หรือไม่
ไม่ควร เพราะอาจปนเปื้อนและทำให้หลักการปริมาตรของวิธีผิดไป
ควร pre-wet ทิปหรือไม่
มักช่วยให้ผลสม่ำเสมอ โดยเฉพาะปริมาตรต่ำ แต่ควรยึดวิธีที่ผ่านการยืนยันของงานนั้น
Reverse ใช้กับ PCR ได้หรือไม่
อาจเหมาะกับ master mix บางชนิด แต่ต้องยืนยันวิธีทั้งระบบ ส่วนสารละลายทั่วไปมักใช้ Forward
สรุป
ความแตกต่างสำคัญอยู่ที่ตำแหน่งเริ่มดูดและสิ้นสุดการจ่าย ใช้ Forward เป็นวิธีทั่วไป และใช้ Reverse เมื่อฟองหรือการเกาะทิปทำให้ผลไม่สม่ำเสมอ ไม่ว่าวิธีใดต้องควบคุมทิป มุม ความลึก ความเร็ว และเวลาให้คงที่
